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細菌賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法定量

更新時間:2023-02-22  |  點擊率:464

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 細菌賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

 細菌賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過單肽化合物底物acetyl-Lys-pNA,受到氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的水解,釋放出黃色對硝基苯胺,即采用比色法來測定樣品中酶活性而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種牙周炎細菌裂解萃取液、培養上清、牙周縫隙液體等樣品氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的特異活性檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定。

 

技術背景

 

牙齦卟啉菌蛋白酶(gingipain)是一種胰蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase),常見于細菌表面、細胞外基質囊泡內以及細菌培養上清,為膜結合型和細胞外分泌型,有2個類型:精氨酸依賴特異性(arginine specific;Rgp)和賴氨酸依賴特異性(lysine specific;Kgp)。前者有2個同工酶:RgpARgpBRgpA又分成HRgpA、RgpAcat)和mtRgpA;RgpB又分成RgpBmtRgpB。牙齦卟啉菌蛋白酶也是一種毒力因子,為革蘭氏陰性厭氧細菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、等多種細菌生長提供營養,使血液凝結和纖維溶解(fibrinolytic)通路,以及免疫系統失調,激活激肽釋放酶(kallikerin)和激肽(kinin)通路,調節宿主細胞因子網絡,活化基質金屬蛋白酶和血小板,切離層粘連蛋白(laminin)、纖連蛋白(fibronectin)、膠原蛋白等,間接促成牙周組織浸入和破壞,誘導細胞凋亡、CAM分子分解和細胞脫離(失巢凋亡anoikis),導致牙周病發生,甚至心血管疾病、風濕性關節炎和阿茨罕默癥等。牙齦卟啉菌蛋白酶成為藥物靶標。基于人工合成的單肽化合物底物acetyl-Lys-p-Nitroaniline;乙酰賴氨酰對硝基苯胺),受到氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的水解,釋放出黃色對硝基苯胺405nm 波長),來定量測定氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的特異活性。氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶反應系統為:

 

 

產品內容

 

 裂解液(Reagent A         毫升

 緩沖液(Reagent B         毫升

 陰性液(Reagent C           毫升

 底物液(Reagent D           微升

產品說明書              1

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里; 底物液(Reagent D)避免光照和反復凍融;有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器

微型臺式離心機:用于樣品沉淀

培養箱:用于反應物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿:用于樣品比色測定的容器

酶標儀或分光光度儀:用于樣品比色分析

 

實驗步驟

 

一、 樣品制備

 

1. 準備好500微升待測細菌(OD6000.81,即12 X 107/毫升)

2. 轉移到到1.5毫升離心管

3. 放進4微型臺式離心機離心5分鐘,速度為1000g(或3500RPM,例如EPPENDORF 5415

4. 小心移取上清液到新鮮的1.5毫升離心管——此為占85%細菌外分泌型酶蛋白

5. 加入xx微升 裂解液(Reagent A,充分混勻

6. 強力渦旋震蕩15

7. 置于冰槽里15分鐘

8. 放進4微型臺式離心機離心15分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

9. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管——此為占細菌內結合型酶蛋白

10. 分別移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1

11. 即刻放進-70保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

二、 測定準備

 

1. 準備好上述制備的待測樣品

2. 設定好酶標儀(溫度為37℃):波長405nm

3. 實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的 底物液(Reagent D手心融化,避免光照

 

三、 活性測定

 

1. 96孔板上做好相應標記:背景對照和樣品

2. 分別移取xx微升 緩沖液(Reagent B到相應孔

3. 分別加入xx微升 陰性液(Reagent C或上述制備的待測樣品(50微克蛋白)到相應孔(注意:樣品須清澈

4. 分別加入xx微升 底物液(Reagent D

5. 輕輕搖動96孔板(注意:避免氣泡

6. 37℃溫度下孵育30分鐘(注意:可見反應孔里呈現肉眼可見的黃色

7. 即刻放進酶標儀檢測或轉移到100微升比色皿,在分光光度儀里檢測

8. 活性計算:

 

 

(1) 酶標儀檢測

 

 

(2) 比色皿檢測

 

 

注意事項

 

1. 本產品為21次(96孔板)操作,包括背景對照

2. 操作時,須戴手套

3. 系統操作過程中,背景測定只需1

4. 樣品須澄清,且避免反復凍融

5. 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升;如果樣本酶活性過低,即30分鐘讀數過低,則可以延長反應孵育時間至2小時;其次增加樣本量(本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1

6. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度

7. 氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶單位活性定義為:在37,pH 7.6條件下,每分鐘內能夠切離1微摩爾肽化合物底物所需的酶量作為一個活性單位

8. 本公司提供系列牙齦卟啉菌蛋白酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

1. 本產品經鑒定性能穩定

2. 本產品經鑒定檢測敏感

 

 


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